北伐军进抵长江流域后，帝国主义列强感到其在华利益进一步受到威胁，一方面继续拉拢蒋介石，一方面加紧准备进行武装干涉。到１９２７年３月，列强在中国水域停泊的军舰已达１７０艘，其中在上海有６０余艘，军队增加到３万多人。３月２３日，国民革命军第二军、第六军从安徽东进，击败直鲁军，占领南京。３月２４日，南京发生劫掠事件，造成外国使馆和侨民的财产损失及人员伤亡。游弋在长江上的英、美军舰借口保护外国侨民，于当日下午炮轰南京城，毁房多间，致使百余人伤亡。南京惨案是帝国主义以武力干预中国革命的严重挑衅事件。这一事件加速了蒋介石同帝国主义势力勾结的步伐。
３月２６日，蒋介石乘军舰从南昌赶到上海，开始与日本驻南京领事和驻上海总领事频繁接触。在秘密商谈后，日本帝国主义者立即宣称南京事件是“由过激分子煽动而起”，其“目的在于摧毁蒋介石”。这时，英、美帝国主义者渲染南京事件是“义和团之祸重演”，仍坚持要对华实行“武力制裁”。日本帝国主义者已摸清革命阵营内部的矛盾和蒋介石的真实态度，认为“武力制裁”未必能够奏效，力主拉拢蒋介石为帝国主义“维持秩序”，“镇压暴行”，并帮助蒋介石巩固地位。日本帝国主义者还将获得的情报和自己的主张频频向英、美通报，以协调它们之间的行动。４月１１日，日本伙同英、美、法、意等国，就南京事件向武汉国民政府外交部长陈友仁和国民革命军总司令蒋介石提出“抗议”照会，实际上是通过软硬兼施的手段促使蒋介石公开反共。
这期间，蒋介石同帝国主义分子、江浙财阀和流氓势力举行了一系列秘密会谈。帝国主义列强公然鼓动蒋介石“迅速而果断地行动起来”，“使长江以南的区域免于沦入共产党之手”。江浙财阀保证在财政上给蒋介石以全力支持。上海的青帮头子黄金荣、张啸林、杜月笙等也保证把大批流氓、暴徒组织和武装起来充当反共打手。蒋介石又调集嫡系部队和其他拥护他的部队控制江、浙两省和沪宁地区，而把没有完全受他控制的军队陆续调开，实现了占领这个富饶地区的计划，从而大大加强了反革命的政治、经济和军事实力。在发动突然袭击的准备工作完成之前，为了迷惑中共中央和上海工人阶级，蒋介石假惺惺地表示允许上海工人纠察队保留枪支，并派代表向上海总工会赠送写有“共同奋斗”字样的锦旗。
４月初，蒋介石在上海约集国民党将领李宗仁、白崇禧、黄绍竑、李济深和国民党中央监察委员张静江、吴稚晖、李石曾等１０余人举行反共秘密会议，诬蔑共产党要打倒国民党，打倒三民主义，贻害北伐军，主张立即以暴力手段“清党”。
４月１２日凌晨，大批青帮武装分子冒充工人，从租界冲出，向分驻上海总工会等处的工人纠察队发动突然袭击。工人纠察队奋起抵抗。双方激战之中，刚刚倒戈参加国民革命军的周凤岐第二十六军第二师开来，声称要调解“工人内讧”。工人纠察队员看到军队将青帮武装分子的枪械收缴，便热情地欢迎这些“调解者”。结果，在毫无戒备的情况下，２０００名纠察队员被军队强行缴械。一部分纠察队员虽进行了英勇的抵抗，但因众寡悬殊，遭到失败。在此前一日，上海总工会委员长汪寿华已被诱骗杀害。事变发生后，上海工人及各界群众发动总罢工和游行示威，表示强烈抗议。４月１３日上午，上海总工会在闸北青云路广场举行有１０万工人参加的群众大会，会后整队游行，要求释放被捕工友，交还纠察队枪械。游行队伍行进到宝山路时，埋伏在里弄内的第二十六军士兵突然冲出，用步枪、机关枪向密集的游行群众扫射，打死１００多人。此后，疯狂的搜捕和屠杀继续进行。到４月１５日，上海工人３００多人被杀，５００多人被捕，５０００多人失踪。这就是震惊中外的四一二反革命政变。
在上海发生反革命政变前后，四川、江苏、浙江、安徽、福建、广西和广东等省也发生以“清党”为名，对共产党人和革命人士进行大屠杀的事件。在四川重庆，反共势力制造了三三一流血惨案，封闭国民党各级党部和省农协、市总工会、市妇联会，搜捕共产党员和革命群众，伤亡４００多人，重庆地委书记杨闇公等人惨遭杀害。在广州，李济深制造了四一五惨案，仅７天被捕者即达２１００人，其中共产党员约６００人，被秘密杀害者１００多人。著名共产党人李启汉、刘尔崧、萧楚女、邓培、熊雄等英勇就义。
与此同时，北方的奉系军阀张作霖也命令军警在北京逮捕大批共产党员及其他革命者。中国共产党的主要创始人和领导人之一李大钊于４月６日不幸被捕。面对敌人的威胁利诱和严刑逼供，他大义凛然，坚贞不屈，表现了一个共产党员坚强的革命意志和崇高的献身精神。４月２８日，李大钊等２０名革命者从容走上绞刑台，英勇就义。中共北方区委同时遭到严重破坏，被迫停止工作。
蒋介石发动的四一二反革命政变，是大革命从高潮走向失败的转折点。它使中国政治风云突变，造成革命联合战线内部的巨大变动与分化。
蒋介石背叛革命的行动不仅得到大资产阶级的支持，而且在一段时间内得到一些民族资产阶级上层人物的附和。上海商业联合会于４月１７日致电南京国民党当局，攻击共产党，并表示“对于当局清党主张愿为后盾”。
蒋介石集团的叛变和突然袭击的卑鄙行径，引起了举国激愤。４月１３日，上海知名人士郑振铎、胡愈之等七人联名写信，声讨蒋介石的暴行。４月１７日，武汉国民党中央发布命令，宣布开除蒋介石的党籍，并免去其本兼各职，“着全体将士及革命民众团体拿解中央，按反革命罪条例惩治”。武汉政府控制下的武汉、长沙等地召开有数十万群众参加的反帝讨蒋大会。国民党陕西省党部在共产党员的领导下，组织２０００名国民党员在西安举行反蒋大会。４月２０日，中共中央发表宣言，揭露“蒋介石业已变为国民革命公开的敌人”、“帝国主义的工具”，并提出“无产阶级农民与中等阶级的民主主义专政万岁”的口号，号召革命人民为“推翻新军阀蒋介石”、“打倒军事专政”而斗争。
共产党人并没有被大屠杀所吓倒。在一些充满白色恐怖的地区，顽强的共产党人仍在进行着革命活动。４月中旬，中共广东区委派周其鉴等到韶关指导北江地区的革命斗争。４月下旬，广东区委决定由彭湃、杨石魂、张善铭等七人组成中共东江特别委员会，领导东江地区的党政军工作。７月中旬，琼崖特委将所辖各县革命武装统一改编为琼崖讨逆革命军，冯平任总司令，杨善集任党代表，向反动民团发起进攻。在澄海、五华、中山、英德、紫金、惠来、梅县、海丰、陆丰、郁南、丰顺、惠阳等县，均有农军和农民的武装暴动。中共广东特委（１９２７年５月２０日，中共广东区委改称中共广东特委——作者注）指出：各地的暴动表面上虽被反革命派镇压摧残，但已给反革命派重大打击，各级党组织必须坚决地鼓动农民起来进行有计划的暴动，即使是斗争艰难的地方，也必须设法建立各种形式的农民秘密组织，开展对敌斗争。
